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《Acta Biomater》:3D培養神經(jīng)干細胞球狀體薄片移植改善腦損傷

瀏覽次數:7901 發(fā)布日期:2023-7-4  來(lái)源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
對于輕度創(chuàng )傷性腦損傷(TBI)后的神經(jīng)元功能障礙,目前尚無(wú)有效的臨床適用的治療方法。為此,韓國翰林大學(xué)Jin Pyeong Jeon教授及其團隊評估了一種新的使用水凝膠的小鼠神經(jīng)干細胞(mNSC)球狀體傳遞方法的治療效果,以改善輕度創(chuàng )傷性腦損傷后的皮質(zhì)損傷和認知障礙。采用水凝膠培養系統從心室下區和顆粒下區分離mNSCs。綠色熒光蛋白(GFP)轉導的mNSCs被生成球狀體,并包裹成薄片進(jìn)行移植。將雄性C57BL/6J小鼠隨機分為4組:假手術(shù)、TBI、TBI加mNSC球狀體移植、TBI加mNSC球狀體薄片移植。在創(chuàng )傷后移植后7、14和28天評估組織病理學(xué)和免疫組化特征和認知功能。從成年小鼠中成功建立了水凝膠培養系統和mNSC分離。NSCs的必需轉錄因子在mNSCs中高表達,如SOX2、PAX6、Olig2、巢蛋白和雙皮質(zhì)素(DCX)。移植的水凝膠基mNSC球狀體薄片具有良好的移植和存活能力,分化為T(mén)UJ1陽(yáng)性神經(jīng)元,促進(jìn)血管生成,減少神經(jīng)元變性。此外,接受mNSC球狀體薄片移植治療的TBI小鼠對新物體的偏好顯著(zhù)增加,表明與mNSC球狀體或未接受治療的組相比,認知功能得到改善。因此,水凝膠mNSC球狀體薄片移植顯示腦外傷后傳遞細胞在惡劣微環(huán)境中的移植、遷移和穩定性,通過(guò)重建受損皮質(zhì),改善認知功能。

相關(guān)研究?jì)热菀?ldquo;Therapeutic effect of a hydrogel-based neural stem cell delivery sheet for mild traumatic brain injury”為題于2023年6月23日發(fā)表在《Acta Biomater》期刊。
 
圖1 小鼠腦源性NSCs的分離和長(cháng)期培養

培養1周后確認mNSCs的出現,然后從腦組織碎片持續增殖和遷移到水凝膠中(圖1A)。采用選擇水凝膠裂解法分離出水凝膠中的高密度mNSC,并采用matrigel包覆的2D培養法成功傳代(圖1B)。通過(guò)集落形成單元(CFU)實(shí)驗,三種培養物均證實(shí)了mNSCs的自我更新能力(圖1C、D)
 
圖2 2D培養中分離的mNSC的免疫表型特征

分離的mNSCs通過(guò)SVZ和SGZ中以特異性的NSCs標記物表達(圖2A)。流式細胞術(shù)分析顯示,大量的mNSCs表達SOX2、巢蛋白、PAX6、DCX和Olig2。當使用大腦中存在的幾種成熟細胞標記物來(lái)確認分離的mNSCs的純度時(shí),神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、平滑肌細胞和小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞的標記物只顯示出很少的表達(圖2B-D)。
 
圖3 mNSC球狀體的體外多重分化潛能和遷移能力

通過(guò)3D構建來(lái)考慮表型、粘附和代謝的影響。免疫熒光染色結果顯示,2D單層條件下的mNSCs的微管蛋白、beta3III類(lèi)(TUJ1)、微管相關(guān)蛋白2(MAP2)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)和Olig2均呈陽(yáng)性(圖3A)。在3D球形條件下,其表達水平升高。其中NeuN和S100B表達明顯,提示終末分化的神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞或少突膠質(zhì)細胞或少突膠質(zhì)細胞(圖3B)。RT-PCR結果顯示,分化的mNSCs在3D球狀體條件下的mRNA水平升高(圖3C)。mNSC SP具有連續遷移/入侵水凝膠的能力,利用轉換后的8位圖像的面積測量來(lái)估計遷移/入侵距離(圖3D、E)。
 
圖4 基于水凝膠的增強綠色熒光蛋白的mNSCs 3D組織工程

在本研究中,使用慢病毒增強的綠色熒光蛋白(EGFP)跟蹤系統評估移植的mNSC球狀體在損傷病變中的植入、分化和重建(圖4A)。慢病毒感染3天后,大多數mNSCs顯示GFP表達,沒(méi)有形態(tài)學(xué)變化,并形成球狀體(圖4B)。根據每個(gè)細胞數的直徑,確定球狀體的最佳細胞數在1000~2000個(gè)細胞之間(圖4C、D)。為了在大規模上生成均勻的球狀體,推薦直徑約為100 μm,根據細胞數量?jì)?yōu)化了培養條件(圖4E)。作者觀(guān)察了mNSC在水凝膠中的遷移和球狀體之間的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò )結構(圖4F)。
 
圖5 輕度TBI模型中mNSC球狀片移植后mNSC的治療效果

與TBI和原位凝膠小鼠相比,GFP陽(yáng)性的mNSCs在損傷的皮質(zhì)中存活了7、14和28 天,這表明通過(guò)mNSC球狀體薄片移植可以防止大規模的細胞丟失(圖5A、B)。在沿胼胝體的海馬額葉區也觀(guān)察到GFP陽(yáng)性的mNSCs,表明其具有體內遷移能力(圖5C)。宿主組織的皮質(zhì)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞被整合并相互作用,引導移植的mNSCs的軸突生長(cháng)(圖5D)。mNSC SP片可以存活并支持神經(jīng)元細胞在移植后28天內存活(圖5E)。
 
圖6 移植的mNSC球狀薄片可減少輕度創(chuàng )傷性腦損傷模型中的認知障礙

在測量學(xué)習和記憶的NOR測試中,與mNSC SP組的mTBI小鼠在7 DPT和28 DPT時(shí)新物體探索的頻率顯著(zhù)增加(圖6A、B)。與使用mNSC SP組的mTBI或mTBI組相比,使用mNSC球狀體薄片移植的mTBI小鼠在移植后7 、14和28 天,新物體探索的頻率顯著(zhù)增加(圖6A、B)。Y-迷宮試驗還顯示,與mNSC SPs移植組相比,使用mNSC球狀體薄片移植組的mTBI小鼠在移植后7 天,新臂進(jìn)入的交替數量顯著(zhù)增加(圖6C、D)。這些數據表明,mNSC球狀體薄片移植可能比mNSC SP移植更有助于改善認知損傷。

綜上所述,本研究建立了一個(gè)在膠原/纖維蛋白水凝膠中來(lái)自成人mNSCs的NSCs的3D培養系統。膠原蛋白和纖維蛋白可以用于創(chuàng )傷后的中樞神經(jīng)系統(CNS)修復,因為它們具有高度的生物相容性、可生物降解和無(wú)毒。本研究表明盡管存在惡劣的微環(huán)境,水凝膠mNSC球狀體薄片的移植顯示了損傷皮質(zhì)病變中傳遞細胞的移植、遷移和穩定性。水凝膠mNSC球狀片可以通過(guò)重建創(chuàng )傷性腦損傷后受損皮質(zhì),為受損認知功能的恢復提供有前途的治療。

文章來(lái)源:
https://doi.org/10.1016/j.actbio.2023.06.027
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