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光片顯微鏡技術(shù)原理及應用

瀏覽次數:6297 發(fā)布日期:2023-8-24  來(lái)源:本站 僅供參考,謝絕轉載,否則責任自負
自17世紀荷蘭科學(xué)家列文虎克研制出光學(xué)顯微鏡以來(lái),人類(lèi)對于微觀(guān)世界的探索如火如荼。光學(xué)顯微鏡由于其對樣品損傷低、成像機制多等優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)成為了微觀(guān)醫學(xué)研究上不可或缺的工具。隨著(zhù)生物醫學(xué)領(lǐng)域研究不斷拓展,對于光學(xué)顯微鏡的成像速度、空間分辨率、成像質(zhì)量等方面也提出了更高的要求。

目前新型顯微鏡主要有雙光子、共聚焦、光片等顯微鏡。而光片顯微鏡在近幾年飛速發(fā)展,以大視野、成像速度快、低光毒性、低光漂白等優(yōu)勢而被廣泛關(guān)注。

光片顯微鏡原理
    光片熒光顯微鏡,是一種新型的三維顯微成像技術(shù),采用正交光路設計,用一層薄光片從側面激發(fā)樣品,并且在垂直于光片的方向上利用顯微物鏡和數字相機拍攝樣品的二維熒光圖像,通過(guò)軸向掃描光片或移動(dòng)樣品逐面成像,獲取不同深度處的層析圖像最終實(shí)現樣品的三維重構。

圖1. 光片顯微鏡結構示意圖
 
光片顯微鏡的優(yōu)勢
1. 大視野、成像速度快
光片顯微鏡采用的是高QE的CCD或者sCMOS相機,可以做到面成像,大大提高了成像的速度和圖像的信噪比。工作時(shí),光片一次曝光穿過(guò)樣品,得到的光學(xué)切片可以得到在此平面上樣品的全部信息,大大減少了成像需要的時(shí)間。
2. 低光毒性、低光漂白
光毒性是指在較長(cháng)時(shí)間的強光照射下,生物樣本細胞內的熒光分子會(huì )產(chǎn)生分解現象。光漂白是指熒光成像的質(zhì)量很大程度上依賴(lài)于熒光信號強度,提高激發(fā)光強度固然可以提高信號強度,但當激發(fā)光的強度超過(guò)一定限度時(shí),光吸收就趨于飽和,并不可逆地破壞激發(fā)態(tài)分子。
光片顯微鏡與傳統的熒光照明技術(shù)相比,光照是從樣品的側面發(fā)出,只會(huì )照亮平面上的樣品組織,這樣光毒性可以被降低很多倍,可以在更接近生理狀態(tài)的條件下,對活體生物樣品進(jìn)行長(cháng)時(shí)間的三維成像。
3. 對比度高
提高了圖像和背景的反差和軸向分辨率,光片照明技術(shù)使焦平面上下的樣品不會(huì )被激發(fā)。
 

圖2. 傳統顯微鏡與光片顯微鏡的差異
 
樣品組織透明化
由于細胞中的色素及其它成分對光的散射和吸收,使光難以達到生物組織的深處。組織透明化技術(shù)(Tissue Clearing)是破解這一難題最重要的技術(shù)手段之一。生物組織是由不同光學(xué)特性的非均質(zhì)成分組成,這會(huì )使入射光進(jìn)入之后發(fā)生散射,限制光學(xué)成像的深度。對此,目前科研人員開(kāi)發(fā)了三種組織透明化的方法。
①油性生物組織透明化方法
油性組織透明化主要是利用帶有高折射率介質(zhì)的光學(xué)透明劑取代組織中原本的水分和脂質(zhì)來(lái)平衡折射率,這種方法透明化效果較好,但是熒光蛋白容易被破壞,信號不易保存。
②水凝膠透明化方法
水凝膠方法主要是將樣品包埋在水凝膠中,使樣品中的蛋白質(zhì)和核酸分子與水凝膠形成共價(jià)連接,從而起到保護和固定作用。
③水性生物組織透明化方法
由于組織中的熒光蛋白分子帶有親水基團,所以與油性透明化方法相比,水性更利于熒光信號保存,但是也存在透明時(shí)間較長(cháng)、透明度差等缺點(diǎn)。目前分為單純浸泡透明與高水化脫脂透明兩種方法。單純浸泡是利用滲透壓的原理,將組織樣品泡在高折射率溶液中,使得組織內外被溶液被替換,從而平衡折射率。高水化法是利用氨基醇類(lèi)與去垢劑類(lèi)物質(zhì)將樣品組織的脂質(zhì)去除,然后利用水化作用降低樣品折射率實(shí)現組織透明化。

光片顯微鏡應用范圍
借助于光片顯微鏡,腦科學(xué)可應用于全腦神經(jīng)、血管等結構三維高精度成像,用于神經(jīng)退行性疾病、腦栓塞等研究;神經(jīng)科學(xué)可以研究神經(jīng)元神經(jīng)傳導途徑及修復再生能力;呼吸科學(xué)可以用于呼吸系統致病及肺損傷機制、免疫應答及藥物篩選研究;腫瘤學(xué)可以用于腫瘤微環(huán)境,轉移,侵襲及藥物篩選;免疫學(xué)科也可以更完整的研究淋巴系統的發(fā)育過(guò)程;骨科學(xué)可以用于骨骼修復與骨再生相關(guān)研究;發(fā)育科學(xué)可以用于研究模型動(dòng)物各個(gè)階段的組織與器官的發(fā)育和功能。 
來(lái)源:廣東駿楠光子科技有限公司
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